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儋州网:云南地区猪毕氏微孢子虫的分子检测及其基因型鉴定

亚博体育app下载安装苹果发布时间:2019-01-11 阅读:

摘要:【目的】从寄生虫角度明确猪场发生猪腹泻的主要病原体,为防控云南规模化猪场毕氏微孢子虫感染提供理论依据。【方法】通过巢式PCR对云南玉溪和保山地区4个猪场的129份猪粪样本进行猪毕氏微孢子虫检测,扩增微孢子虫的ITS序列,经测序分析和构建系统发育进化树确定其基因型。【结果】129份猪粪样中有30份感染毕氏微孢子虫,感染率为23.26%;其中,云南保山地区的猪毕氏微孢子虫感染率为56.82%(25/44),玉溪地区的感染率为5.88%(5/85),二者差异极显著(P<0.01,下同)。按不同发育阶段划分,发现以仔猪的毕氏微孢子虫感染率最高(76.92%),成年猪的感染率相对较低(11.39%),感染率在不同发育阶段间差异极显著。经测序分析发现共有6个基因型,包括5个已知基因型[CHC5(n=3)、CHG19(n=7)、EbpD(n=9)、EbpA(n=2)和EbpC(n=4)],1个新的基因型YNZ1(n=5);从基于微孢子虫ITS序列同源性构建的系统发育进化树可知,检测出的6种基因型均属于Group 1,即具有人兽共患的可能性。【结论】云南猪场普遍存在毕氏微孢子虫感染,且均属于具有人兽共患可能性的基因型。因此,要重点加强猪场微孢子虫的防控工作,养殖过程中产生的粪便等养殖污染物必须经过堆肥发酵或消毒处理后才能作为农家肥使用或排入污水中。

关键词: 猪;微孢子虫;ITS序列;基因型;云南

中图分类号: S858.28 文献标志码:A 文章编号:2095-1191(2018)08-1654-06

0 引言

【研究意义】微孢子虫(Microsporidian)广泛分布于自然界,是一种重要的人兽共患寄生原虫,可感染包括猪在内的多种家畜及人类(杜海利,2013)。微孢子虫感染以引起宿主腹痛和腹泻为主,其致病机理为成熟孢子在肠绒毛上皮细胞内大量繁殖,从而导致肠绒毛缩短且表面积减小,引起寄主吸收不良,有时还伴有腹泻症状(Franzen and Müller,1999)。微孢子虫感染主要呈隐性感染状态,对于幼畜来说极易引起吸收不良而影响其生长发育,对于免疫缺陷的动物则多因严重腹泻而脱水死亡。微孢子虫可寄生于人体肺脏、胆管和肝脏等器官,引起肺部感染、胆囊炎和肝炎等;还可感染眼部,引起结膜炎等(杜海利,2013)。由于不同宿主所感染的微孢子虫基因型不同,且不同基因型对宿主的致病性也存在明显差异(Santín and Fayer,2009),因此,獲悉当地宿主所感染微孢子虫的基因型信息,对防控微孢子虫病具有重要的公共卫生学意义。【前人研究进展】目前已鉴定的微孢子虫基因型超过200个,据统计超过90%的微孢子虫病是由毕氏微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)所引起(Zhang et al.,2016)。由于毕氏微孢子虫的核糖体内部转录间隔区(ITS)序列在不同分离株间多态性较强,依据ITS序列差异对毕氏微孢子虫进行基因分型已成为当前公认的标准方法(Santín and Fayer,2009)。现已证实微孢子虫包括160个属1400多个种,其中有8个属14个种具有人兽共患特性(Mathis et al.,2005;杜帅之等,2016),包括毕氏微孢子虫、兔脑炎微孢子虫、海伦脑炎微孢子虫和肠脑炎微孢子虫等。在我国,关于奶牛、绵羊、山羊和猪等家畜感染微孢子虫的案例已有报道。Zhang等(2011)从我国流行的肠道细胞虫病中鉴定出12个毕氏微孢子虫基因型,其中10个为新基因型。杜海利(2013)首次对河南省部分地区猪、羊的毕氏微孢子虫病流行情况进行调查,发现感染猪、羊的毕氏微孢子虫与分离自人类的3个基因型毕氏肠微孢子虫同源性高达100%,即猪源、羊源毕氏肠微孢子虫具有人兽共患风险。Jiang等(2015)以我国东北部多个城市的489头绵羊和537头牛的粪便标本为研究对象,通过PCR和ITS测序对肠道细胞虫病的流行和遗传特征进行分析,发现了9个已知基因型(BEB4、BEB6、CM7、CS-4、EBPC、G、I、J和OEB1)和11个新基因型(NESH1~NESH6和NECA1~NECA5),其中近70%绵羊毕氏微孢子虫感染病例是由人类致病基因型BEB6、CS-4和EBPC所贡献。万强(2016)从我国东北5个地级城市563份非腹泻猪的粪便样本中检测到267份毕氏肠微孢子虫,鉴定出11个已知毕氏肠微孢子虫基因型和1个新基因型(CS-10),其中,Ebp C、O、CS-4、Ebp A、Henan-IV和Pig EBITS5为人兽共患基因型。刘婷丽等(2017)采用基于微卫星(MS1、MS3和NS7)和小卫星(MS4)位点的多位点序列分型技术对陕西省部分地区不同用途山羊的毕氏肠微孢子虫分离株进行多位点序列分型研究,结果显示在MS1、MS4和MS7位点的扩增效率依次为27.9%、18.0%和50.8%,而在NS3位点所有样品均未获得有效扩增。【本研究切入点】云南部分亚博体育app下载安装苹果场普遍存在猪腹泻情况,通过诊断检测已排除病毒和细菌感染,因此需从寄生虫角度明确这些猪场发生猪腹泻的主要病原体,但至今关于云南地区猪毕氏微孢子虫感染的研究尚无报道。【拟解决的关键问题】通过巢式PCR对云南玉溪和保山地区4个猪场进行猪毕氏微孢子虫检测,明确导致猪腹泻的主要病原体及其基因型,为防控云南规模化猪场毕氏微孢子虫感染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2016年11月~2017年1月,分4次在云南玉溪和保山地区4个猪场采集129份猪粪样本,其中85份来自云南玉溪地区、44份来自云南保山地区。

1.2 DNA提取

取约2.0 g粪样加水混匀,除去杂质,3000 r/min离心3 min,收集沉淀。吸取250.0 μL沉淀,参照DNA提取试剂盒[Stool DNA Kit(200),OMEGA公司]说明提取DNA,-20 ℃保存备用。